Il progetto Hemibio ha sviluppato un bioreattore microfluidico epatico che imita la struttura del fegato umano. Il nuovo dispositivo contribuirà all’eliminazione delle analisi chimiche condotte sugli animali.
Il fegato ha un ruolo fondamentale per trasformare e purificare le sostanze chimiche che assorbiamo ogni giorno e questo lo rende uno degli organi principali studiati nei test di tossicità. Gli scienziati stanno tuttavia ancora cercando il metodo migliore per effettuare questi test con risultati affidabili al 100%, infatti la sperimentazione oggi avviene ancora quasi sempre sugli animali invece che sull’uomo, .
Per superare questo problema, il consorzio Hemibio ha sviluppato un dispositivo in grado di simulare la complessa struttura del fegato umano, mettendolo a disposizione per i test pre-clinici di tossicità nell’ambito dell’iniziativa SEURAT-1.
Il dispositivo messo a punto dal team di ricercatori di Hemibio imita la struttura del fegato umano su chip ed è in grado di mantenere attivi, dal punto di vista metabolico, gli organoidi del fegato per oltre un mese in vitro, con una precisione di misurazione delle concentrazioni tossiche pari al 99%.
Catherine Verfaillie, direttrice dell’Istituto di cellule staminali della KU Leuven, è la coordinatrice del progetto.
Hemibio è nato da collaborazioni precedenti tra i molti partecipanti al progetto, tra cui Verfaillie, Luttun, Van Grunsven, Rogiers, Sancho-Bru, Collas, Nahmias e Van Fleteren che da molto tempo lavorano per ricreare un modello in vitro del fegato umano, per studiare la tossicità e l’epatite virale, attraverso la creazione di cellule di fegato parenchimatiche e non parenchimatiche, associate tra loro attraverso piccoli bioreattori microfluidici.
Poiché tutto il team era particolarmente interessato all’ingegnerizzazione del tessuto epatico, il progetto Hemibio è stato visto come un’opportunità per ampliare la collaborazione europea e incidere in modo significativo allo sviluppo di test alternativi a quelli di tossicità in vivo. I partner coinvolti sono delle eccellenze in biologia del fegato, tossicologia, ingegneria del genoma, tecnologia e microfabbricazione di sensori.
Prima del progetto Hemibio erano stati finanziati dalla CE diversi progetti che avevano come obiettivo la riduzione dell’uso di animali nei test di tossicità.
Finora, per ottenere una valutazione sugli effetti tossici derivanti da un’esposizione a lungo termine a farmaci, sostanze chimiche e cosmetiche, era necessario ricorrere spesso all’uso di animali. Inoltre, tralasciando tutte le considerazioni etiche, era comunque necessario l’uso di cellule umane, come strumento per armonizzare le frequenti discordanze tra la tossicità riscontrata nei modelli animali e gli effetti reali sugli esseri umani.
Si doveva quindi creare un dispositivo che simulasse il fegato e che fosse adatto per eseguire i test di tossicità a lungo termine. I componenti cellulari del fegato dovevano perciò essere utilizzabili per lunghi periodi di tempo (superiori a un mese), con un’appropriato funzionamento metabolico e di trasporto e una fisiologia paragonabile a un fegato in vivo.
Per ottenere questo risultato occorreva tener conto del flusso attraverso il dispositivo, l’azione degli epatociti (e alcune cellule epatiche non parenchimali), e l’impatto delle cellule non parenchimali sulla funzione e sulla tossicità a valle del componente parenchimale – in particolare quando riguardavano uno dei risultati tossici, la fibrosi e la cirrosi epatica.
La fibrosi e la cirrosi epatica sono causate da un’interazione della tossicità degli epatociti e dell’attivazione delle cellule stellate del fegato che hanno causato un deposito di collagene, insieme a cambiamenti delle cellule endoteliali sinusoidali del fegato che perdono la loro specifica membrana fenestrata. Tali cambiamenti possono essere studiati solo all’interno di un dispositivo nel quale siano presenti diversi componenti della cellula.
Con Hemibio si sono ottenuti cinque importanti passi avanti. In primo luogo, è stato sviluppato un dispositivo di fegato su chip in grado di mantenere attivi, dal punto di vista metabolico, gli organoidi del fegato per oltre un mese in vivo, con gradienti di ossigeno che imitano il micro ambiente di origine. Questo dimostra i vantaggi specifici della tecnologia umana su chip, poiché i metodi attuali si basano su un’esposizione giornaliera a farmaci e a dozzine di analisi di punti finali – che danno come risultato delle informazioni cinetiche e valori prognostici limitati.
Un secondo risultato è stato la produzione di una variegata collezione di colture polarizzate, funzionali dal punto di vista metabolico, e proliferanti di epatociti umani primari – il punto di riferimento per gli studi di tossicità dei farmaci. Le cellule potevano prevedere con precisione il profilo TC50 [50% di concentrazioni tossiche] di 12 componenti, con una precisione senza precedenti del 99% (rispetto al 60% delle cellule HepG2/C3A). Sono stati generati cinque diversi genotipi a partire da pazienti di etnie diverse, grazie ai quali è ora possibile studiare il variare degli episodi di tossicità idiosincratica tra pazienti di popolazioni diverse.
Un terzo risultato è stata la possibilità di creare, usando co-colture di epatociti e cellule stellate, un modello in vitro unico attraverso il quale studiare la tossicità derivante da una dose ripetuta, fino all’induzione finale della fibrosi epatica.
Il quarto step è stato lo sviluppo di cellule staminali pluripotenti ingegnerizzate dal punto di vista genomico – linee di cellule hPSC – adatte allo scambio di cassetta mediato dalla ricombinasi (RMCE) nel luogo genetico AAVS1, che permette la generazione di linee transgeniche entro 3-4 settimane con un’efficienza del 100% e senza integrazioni casuali. Usando RMCE è stato possibile incorporare diversi transgeni utili per l’identificazione della discendenza, per gli studi di tossicità e sovra-espressione genetica.
Infine grazie a Hemibio si è data una nuova definizione trascrizionale, miRNA e fenotipica dell’epigenoma di cellule stellate del fegato umano, quiescenti e attivate, e si sono stabiliti nuovi sistemi di coltura per mantenere le cellule stellate umane quiescenti in vitro.
Il gruppo del professor Nahmias, presso l’Università ebraica di Gerusalemme, in collaborazione con l’Istituto Fraunhofer e Upcyte Technologies, ha dimostrato che è possibile espandere gli epatociti umani e mantenere la loro funzionalità in un bioreattore microfluidico per oltre 28 giorni, in condizioni di continue misurazioni dell’ossigeno. Questa tecnologia di fegato su chip è in grado di misurare in modo accurato i valori di TC50 di acetaminofene, amiodarone, troglitazone e rotenone, una serie di tossine della lista Gold Compound di Seurat-1, con un R2 di 0,9 in correlazione, in vitro in vivo. La sensibilità del dispositivo ha permesso di rilevare un nuovo meccanismo di tossicità dell’acetaminofene e nuove informazioni sullo sviluppo dei danni provocati dal troglitazone.
Sono anche già stati richiesti diversi brevetti provvisori sia per il bioreattore sia per i metodi e sia per i sensori. Alcuni partner stanno prendendo in considerazione la possibilità di creare, nei prossimi mesi, una società che fornisca servizi di screening per l’industria cosmetica e farmaceutica. Il gruppo The Verfaillie, ha anche creato una piattaforma iPSC per la valutazione dei farmaci, che in un prossimo futuro verrà automatizzata, in modo da poter generare, differenziare e usare un gran numero di linee di valutazione ad alto rendimento.
Il prossimo obiettivo è quello di riuscire a sostituire gli studi sugli animali con studi umani in vitro, usando organoidi compositi del fegato in bireattori microfluidici caricati con cellule umane in vitro.
Per maggiori informazioni questo è il sito del progetto: http://www.hemibio.eu/
http://www.altex.ch/resources/altex_2015_1_009_024_Gocht1.pdf
